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      樣本制備方法之蛋白提取的總原則及注意事項(xiàng)點(diǎn)擊次數(shù):5243 更新時(shí)間:2020-11-17

            樣本制備是實(shí)驗(yàn)的步驟,也是決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵步驟,獲得的蛋白質(zhì)樣品必須均質(zhì)、可溶,并解離成單個(gè)多肽亞基,且盡量減少相互間的聚集,使其僅依賴本身的分子量大小進(jìn)行分離。常見(jiàn)的樣本來(lái)源有重組蛋白、細(xì)胞和組織等。

       蛋白提取的總原則和注意事項(xiàng):

          1.盡可能提取*或降低樣本復(fù)雜度,只集中提取目的蛋白;

          2.保持蛋白處于溶解狀態(tài)(通過(guò)裂解液的pH鹽濃度,表面活性劑,還原劑等的選擇);

          3.提取過(guò)程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修飾等(低溫操作,加入合適的蛋白酶和磷酸酶抑制劑);

          4.盡量除去核酸、多糖、脂類等干擾分子(通過(guò)加入核酸酶或采取不同提取策略);

          5.樣品分裝,長(zhǎng)期于-80℃保存,避免反復(fù)凍融。

          細(xì)胞裂解:

          1.培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗2次,裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑;

          2.吸盡PBS,加入預(yù)冷的裂解液(1mlper107cells/100mmdish/150cm2flask);

          3.用細(xì)胞刮子刮取貼壁細(xì)胞,將細(xì)胞及裂解液溫和地轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的微量離心管中;

          4.4℃搖動(dòng)30mins;

          5.4℃,12000rpm離心20mins;

          6.輕輕吸取上清,轉(zhuǎn)移至新預(yù)冷的微量離心管中置于冰上,即為蛋白樣本,棄沉淀。

          組織裂解:

          1.用滅菌的預(yù)冷的工具分離目的組織,盡量置于冰上以防蛋白酶水解;

          2.將組織放在圓底微量離心管或EP管中,加入液氮凍結(jié)組織于冰上勻質(zhì)研磨,長(zhǎng)期可保存于-80℃;

          3.每5mg加入約300ul預(yù)冷的裂解液,冰浴勻漿后置于4℃搖動(dòng)2小時(shí),裂解液體積與組織樣本量有適當(dāng)比例(蛋白濃度至少達(dá)0.1mg/ml,理想的蛋白濃度應(yīng)為1-5mg/ml);

          4.4℃,12000rpm離心20mins,輕輕吸取上清,轉(zhuǎn)移至新預(yù)冷的微量離心管中置于冰上,即為蛋白樣本,棄沉淀。

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