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      樣本制備方法之蛋白提取的總原則及注意事項點擊次數:5242 更新時間:2020-11-17

            樣本制備是實驗的步驟,也是決定實驗成敗的關鍵步驟,獲得的蛋白質樣品必須均質、可溶,并解離成單個多肽亞基,且盡量減少相互間的聚集,使其僅依賴本身的分子量大小進行分離。常見的樣本來源有重組蛋白、細胞和組織等。

       蛋白提取的總原則和注意事項:

          1.盡可能提取*或降低樣本復雜度,只集中提取目的蛋白;

          2.保持蛋白處于溶解狀態(通過裂解液的pH鹽濃度,表面活性劑,還原劑等的選擇);

          3.提取過程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修飾等(低溫操作,加入合適的蛋白酶和磷酸酶抑制劑);

          4.盡量除去核酸、多糖、脂類等干擾分子(通過加入核酸酶或采取不同提取策略);

          5.樣品分裝,長期于-80℃保存,避免反復凍融。

          細胞裂解:

          1.培養的細胞經預冷的PBS漂洗2次,裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑;

          2.吸盡PBS,加入預冷的裂解液(1mlper107cells/100mmdish/150cm2flask);

          3.用細胞刮子刮取貼壁細胞,將細胞及裂解液溫和地轉移至預冷的微量離心管中;

          4.4℃搖動30mins;

          5.4℃,12000rpm離心20mins;

          6.輕輕吸取上清,轉移至新預冷的微量離心管中置于冰上,即為蛋白樣本,棄沉淀。

          組織裂解:

          1.用滅菌的預冷的工具分離目的組織,盡量置于冰上以防蛋白酶水解;

          2.將組織放在圓底微量離心管或EP管中,加入液氮凍結組織于冰上勻質研磨,長期可保存于-80℃;

          3.每5mg加入約300ul預冷的裂解液,冰浴勻漿后置于4℃搖動2小時,裂解液體積與組織樣本量有適當比例(蛋白濃度至少達0.1mg/ml,理想的蛋白濃度應為1-5mg/ml);

          4.4℃,12000rpm離心20mins,輕輕吸取上清,轉移至新預冷的微量離心管中置于冰上,即為蛋白樣本,棄沉淀。

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